Что такое генетическая инженерия?

В Законе Республики Беларусь «О безопасности в генно-инженерной деятельности» дается следующее определение генетической инженерии: «Генетическая инженерия — получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства».

Первый этап создания генно-инженерных организмов — выделение и идентификация отдельных генов (соответствующих фрагментов ДНК или РНК), которые собираются перенести другим организмам. Для этого из организмов, обладающих такими генами, с помощью специальных химических методов выделяют нуклеиновые кислоты и разрезают их на отдельные фрагменты, используя наборы ферментов — рестриктаз. Первые рестриктазы были выделены в 1970 году Г.Смитом (США). Оказалось, что разные рестриктазы способны производить разрывы молекулы ДНК в строго определенных последовательностях нуклеотидов (из 4-6 пар). Наибольшее значение имело выделение рестриктаз, которые дают фрагменты с так называемыми «липкими» (комплементарными) концами. В случае их использования разрывы ДНК происходят в местах, расположенных наискось: на концах каждого из полученных фрагментов остаются короткие одноцепочечные «хвосты» из нескольких нуклеотидов. Если объединить в одной пробирке фрагменты ДНК любого происхождения, полученные с помощью одной и той же рестриктазы, дающей «липкие концы», и добавить фермент ДНК-лигазу, то эти фрагменты соединятся между собой. В результате получится химерная — «рекомбинантная» ДНК, которая может содержать фрагменты ДНК, выделенные из самых разных источников, или синтезированные искусственно. Описанная методика получила название «технология рекомбинантных ДНК». Ее по праву считают центральным звеном генетической инженерии. Поэтому можно сказать, что годом рождения генетической инженерии является 1972 г., когда появилась первая публикация сотрудников лаборатории П.Берга (США), в которой сообщалось о получении кольцевой молекулы ДНК вируса SV40, содержащей гены фага лямбда (фаги — это вирусы бактерий) и галактозный оперон (набор генов, ответственных за расщепление молочного сахара лактозы) бактерии Escherichia coli (E.coli).

В 1973 году была получена первая функционально активная молекула рекомбинантной ДНК. Г.Бойер и С.Коэн (США) сумели «пришить» к плазмиде E.сoli фрагмент ДНК плазмиды другой бактерии и обнаружили, что такая химерная плазмида могла успешно функционировать в клетках E.сoli, размножаться и передаваться другим клеткам как естественным путем, так и с помощью человека. Это означало, что таким образом можно получать многочисленные копии любых генов, то есть клонировать гены, нарабатывать требуемые для последующих манипуляций объемы генетического материала. В генетической инженерии в настоящее время используют различные микрорганизмы для клонирования генов, но чаще всего для этой цели привлекают хорошо изученную бактерию пищеварительного тракта человека — E.сoli.

С помощью набора разных рестриктаз получают многие тысячи фрагментов ДНК, содержащих самые разнообразные гены. Каким образом в этой смеси найти и выделить один единственный, который кодирует нужный нам ген? Это один из наиболее сложных и дорогостоящих этапов генетической инженерии. Для решения проблемы идентификации генов разработаны и успешно применяются многие методы. Останавливаться на их описании в рамках научно-популярного издания не представляется целесообразным. Замечу только, что в основе большинства из них лежит хорошо известный нам принцип комплементарности нуклеотидов ДНК.

Ученые научились не только выделять и клонировать нужные гены, но и всесторонне их изучать: определять последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК и аминокислот в белке, который кодирует ген, механизм регуляции его активности. Все это позволило успешно осуществлять следующий этап создания генно-инженерных организмов: построение конструкций генов, которые предполагается перенести в геном реципиентного организма (по определению генетической инженерии — «получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот»). Здесь не случайно идет речь о переносе не отдельных генов, а генетических конструкций, состоящих из нескольких генетических элементов: генов и регуляторных последовательностей. Как правило, конструкции собирают на основе определеных плазмид, к которым «пришивают» в определенной последовательности необходимые генетические элементы.

Как отмечалось выше, каждый ген имеет сложную систему регуляции своей активности, в отсутствие которой он просто не будет функционировать. Только для транскрипции гена (образования мРНК) обязательно наличие, помимо кодирующей области, также промотора, последовательности, обеспечивающей присоединение к мРНК полиА «хвоста», и последовательности, указывающей место окончания транскрипции. В придачу к этим обязательным элементам генетические конструкции могут содержать также регуляторные элементы, определяющие, например, место и время активности переносимого гена (трансгена), другие гены (с соответствующими генетическими элементами), например, так называемые маркерные гены, с помощью которых выделяют трансформированные клетки реципиентного организма (клетки, в ДНК которых произошло встраивание трансгена) среди преобладающей массы нетрансформированных клеток.

Такие генетические конструкции «собирают» из фрагментов ДНК, которые могут принадлежать совершенно разным организмам, относящимся к весьма отдаленным систематическим группам, и даже с участием фрагментов ДНК, синтезированных искусственно. Например, в плазмиду почвенной бактерии Agrobacterium tumеfaciens (A.tumefaciens) встраивают ген, выделенный из ДНК рыбы (ген холодоустойчивости от камбалы), промотор у этого гена от вируса мозаики цветной капусты, последовательности присоединения полиА-хвоста и окончания транскрипции (терминальные последовательности) от A.tumefaciens, маркерный ген устойчивости к канамицину из транспозона (подвижный генетический элемент) E.coli, промотор и терминальные последовательности у этого гена те же, что и у гена холодоустойчивости. И вся эта генетическая конструкция предназначена для переноса в растительный организм.

Выбор проcмотора при создании трансгенных конструкций имеет особое значение. Существует общая закономерность: прокариотические промоторы могут обеспечить активность любого гена, в том числе и эукариотического, только в прокариотическом организме (у бактерий, сине-зеленых водорослей). В эукариотическом организме может функционировать только ген, имеющий эукариотический промотор. Поэтому при переносе генов от одного вида растений к другому можно использовать гены с их собственными промоторами. Но если в растение переносится бактериальный ген, то промотор у него должен быть заменен на растительный. В последнем случае часто используют промоторы от растительных вирусов. Вирусы по своей природе — существа исключительно активные. Ничто, или практически ничто, не может их остановить после того, как они нашли свою жертву (хозяина). Попав в клетку хозяина, вирусная ДНК интенсивно размножается и, используя «строительный материал и технику» (рибосомы и молекулы, необходимые для трансляции) клетки хозяина, активно воспроизводит себе подобных. Это происходит в силу того, что в процессе эволюции вирусы получили очень сильные промоторы, способные функционировать в любом генетическом окружении. Для генетической инженерии такое свойство вирусных промоторов очень ценно, поскольку обеспечивает активную работу привнесенного в организм трансгена. Правда, с другой стороны, регулировать активность такого гена очень сложно: он работает постоянно и с одинаковой интенсивностью. Во многих случаях это как раз то, что и требуется. Если исследователь ставит более сложные задачи в плане регулирования активности трансгенов, то в его распоряжении имеется в настоящее время достаточно широкий выбор промоторов и других регуляторных элементов, комбинирование которых позволяет достичь более тонкой регуляции активности трансгенов в пространстве (в определенных тканях растения) и времени (в определенный период развития).

Следующий этап создания генно-инженерных организмов — перенос трансгенных конструкций внутрь клетки и встраивание их в ДНК реципиентного организма.

     Тут надо иметь в виду, что есть организмы одноклеточные и многоклеточные. В первом случае все просто: имеются хорошо отработанные методы введения рекомбинантных молекул ДНК в клетки микрорганизмов. Если сконструированная плазмида способна к самовоспроизведению, то она будет размножаться внутри клетки. В свою очередь, сами клетки реципиентного организма быстро делятся вместе с привнесенными в них плазмидами. Так осуществляется клонирование генов в микрооргнизмах. Если стоит задача получить генно-инженерный микрорганизм, то добиваются, чтобы привнесенная в клетку генетическая конструкция включилась (устойчиво интегрировалась) в хромосому реципиентного организма.

Для получения генно-инженерных многоклеточных организмов поначалу трансформируют (то есть, вводят нужный ген) лишь отдельные клетки, из которых затем восстанавливают целый организм. Понятно, что это не простая задача — восстановить организм из отдельной клетки. Однако ученые научились делать это. Так, для получения трансгенных животных (например, млекопитающих: мышей, кроликов, овец, коров и т.д.) чаще всего используют оплодотворенные яйцеклетки, в которые с помощью микроманипуляторов впрыскивают препараты ДНК, а затем имплантируют эти яйцеклетки в матки суррогатных матерей, где из таких яйцеклеток развиваются младенцы, часть из которых может содержать в своем генетическом материале привнесенные гены.

С растениями ситуация, с одной стороны сложнее, с другой – проще. Сложнее – потому, что каждая растительная клетка окружена плотной целлюлезной оболочкой, что создает проблемы с введением в клетку чужеродной ДНК. Проще – потому, что, в отличие от животных, большинство растительных клеток тотипотентны, т.е. из них можно восстановить целое растение (у животных этим свойством обладают только оплодотворенные яйцеклетки и клетки зародыша на самых ранних стадиях развития). В придачу ко всему для растительных клеток разработаны эффективные методы их культивирования вне организма на специальных питательных средах и разработаны методы индукции у низ процессов морфогенеза (с помощью фитогормонов, изменения условий культивирования), в результате чего достигается регенерация из клеток целых организмов.

Проблема введения в растительную клетку чужеродной ДНК также в принципе решена. Используется два основных подхода. Первый из них – агробактериальная трансформация – это слегка модифицированный естественный процесс горизонтального (то есть между отдаленными в систематическом отношении группами организмов) переноса генов от бактерий в растения. В природе существует большая группа почвенных бактерий из рода Agrobacterium. Они могут вызывать у растений болезни типа рака – корончатый галл (опухоль) или «бородатые корни». Выяснилось, что болезнь начинается после того, как бактерии передали с помощью специального механизма в генетический материал растений небольшой фрагмент своей ДНК, содержащий гены, активность которых у растений приводит к образованию опухоли или многочисленных корней, в которых синтезируются вещества – опины – являющиеся питательным субстратом исключительно для агробактерий. Ученые просто вырезали из переносимого фрагмента ДНК бактериальные гены, вызывающие болезнь, и заменили их нужными им генами с соответствующими регуляторными элементами. Агробактерии затем убивают с помощью антибиотиков, а из трансформированных клеток восстанавливают целое растение.

К сожалению, метод агробактериальной трансформации оказался недостаточно эффективным для большинства однодольных растений (хлебных злаков, кукурузы, лилейных и др.). Поэтому для введения чужеродной ДНК в клетки таких растений чаще всего используют другой метод – бомбардировки клеток микроскопическими частицами из золота или вольфрама, на поверхность которых нанесена ДНК.

Процесс переноса и включения в генетический материал клеток растений чужеродной ДНК происходит в общем с небольшой частотой: в лучшем случае трансформированной оказывается одна клетка на тысячу. Поэтому необходимо каким-то образом отделить такие клетки от остальных, создать для их деления и дальнейшего развития наиболее благоприятные условия. Для этих целей вместе с желаемым геном (например, устойчивости к насекомым вредителям, вирусам, гербицидам) вводят и второй ген – так называемый селективный ген. Чаще всего для этого используют гены устойчивости к антибиотикам. Если поместить клетки после введения чужеродной ДНК на питательную среду с антибиотиком, то ней способны будут расти только трансформированные клетки.

Обычно в генетический материал клеток растений включается одна или две копии привнесенных генов. Многокопийность, как правило, сопровождается пониженной активностью привнесенных генов, а генотипы с несколькими копиями трансгенов не обладают требуемыми признаками и выбраковываются в ходе селекционного процесса. Даже в случае встраивания одной копии трансгена его активность может быть недостаточной. Поэтому получают много трансформантов, из которых отбирают лучшие по активности трансгенов и по комплексу хозяйственных признаков, без видимых мутаций и других нарушений.

Явление ослабления активности гена при увеличении числа его копий (оно получило название сайлэнсинг – замолкание) весьма широко используется в генетической инженерии для улучшения качественных характеристик сортов или пород. Так, с помощью привнесения дополнительных копий отдельных генов растений получены томаты с длительным сроком хранения (у них снижена активность фермента, разрушающего в процессе естественного созревания пектин, или фермента ответственного за образования фитогормона – этилена), картофель с повышенным качеством крахмала (без амилозы), соя, рапс с улучшенным качеством масла, кофе без кофеина. В генетической инженерии животных таким образом снижают активность генов, ответственных за выработку белков-аллергенов (в креветках, в молоке коров, коз).

Таким образом, генно-инженерные организмы отличаются от исходных генотипов весьма незначительно: к 25–35 тысячам существующих генов добавляют один-два новых. При этом следят, чтобы активность собственных генов растения или животного не изменилась (если это изменение не является целью генетической модификации), чтобы не ухудшились его потребительские качества.